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M09是一种检测细胞膜电位的亲脂性阴离子荧光染料，它本身无荧光，当进人细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光。M09荧光探针容易进入去极化的细胞。增加细胞的去极化，探针流入细胞，细胞内荧光强度增加；反之，细胞内荧光强度降低，表示细胞超极化，膜两侧的电位差增加。M09不受线粒体膜电位影响，使其能特异性的用于测量细胞膜电位变化。M09最大吸收波长490nm，最大发射波长516nm。

• 染料2周内可以2～8℃保存，染料长期不用可以-20℃保存，避免反复冻融。
  
• 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁，注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 可用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需放培养箱预热，否则易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

• 流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦、荧光酶标仪、荧光分光光度计等有488nm激发波长的检测仪器，检测波长510～520nm。
  
• PBS、HBSS、Hepes缓冲液（pH7.4）、纯水
  
• 移液器、离心机

• 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• M09探针在冬天温度较低时会凝固，可以20～25℃水浴温育片刻全部融解后离心使用。
  
• 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
  
• 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。
  
• 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。
  
• 根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。
  
• 染色液产生沉淀离心取上清使用即可，不影响结果。
  
• M09染色并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。
  
• M09染色探针不可以一次性全部配好，应根据每次细胞数量现配现用，长期不用的可以分装后用铝箔纸包好-20℃冻存。避免反复冻融。

• 细胞准备：
  贴壁细胞：96孔板，细胞数量约40000-80000/孔，100μL培养基。
  悬浮细胞：96孔板，细胞数量约125000-250000/孔，100μL培养基。
  组织样本：组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。
  
• 染色工作液准备：
  
  • 在HBSS缓冲液中加入终浓度为20mM的Hepes缓冲液。置37℃培养箱预热。
    
  • 根据样本数量，用37℃培养箱预热的染料稀释液试剂B将M09荧光染料10倍稀释。再用以上HBSS或相应的无血清培养基或其他缓冲液将探针M09进行100～500倍稀释，配制成1×染色工作液。
    注：
    ● 也可以不使用本试剂盒中的试剂B，直接用HBSS等缓冲液或相应的无血清培养基稀释M09染料至所需浓度。M09室温或水浴融解，在1000μL HBSS缓冲液中加入1μL M09细胞膜电位探针，充分混匀配成1×染色工作液。
    ● 开始实验前，使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过5倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度为试剂盒中M09探针母液的1000～5000倍稀释，2000倍适合大多数细胞样本。
    ● 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，-20℃避光冻存，一年稳定。
    ● 工作液现配现用。
• 染色：
  
  • 如果是在培养板原位检测，移除培养基，用PBS洗细胞一次，加入100μL染色工作液。
    注：
    ● 如果细胞样本采用无血清培养基培养，或者染色前换用无血清培养基处理细胞，也可以先配制成2×的染色工作液，染色前不换液，直接等比例加入培养孔充分混匀。
    
  • 如果流式检测，收集样本细胞，细胞数量在2～5×105个。用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞，然后用500μL～1000μL M09染色工作液将细胞重悬。
    
  • 加入染色工作液的细胞在培养箱中或者室温避光孵育30分钟～1小时。
    
  • 用荧光酶标仪/激光共聚焦显微镜或流式细胞仪/荧光分光光度计检测分析结果。
    用荧光酶标仪或激光共聚焦显微镜检测。检测相关刺激后荧光强度的变化。
    注：
    ● 在37℃的条件下测定荧光。
    ● 每隔30秒测定1次荧光变化，也可1分钟或者5分钟。
    ● 例如用K+通道开放剂诱导膜超极化，导致细胞内M09的净流出，检测结果为荧光强度的降低。
    ● 在实验之前运行信号测试很重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到最大仪器强度计数的10%至15%的水平。例如，Molecular Devices FLIPR-384的最大荧光强度计数为65000，因此应调整仪器设置以使其信号测试强度在7000～10000左右。
    或者用流式细胞仪、荧光分光光光度计检测：激发波长为488nm，发射波长为515nm左右。如果激发波长不能设置为488nm时，可以在488～493nm范围内设置激发波长。
• 结果分析：
  检测时可以把激发光设置为488nm，发射光设置为515～520nm；
  荧光强度增加，表示细胞去极化，探针流入细胞。显示细胞跨膜电位较原来的参照状态或参照细胞更正，膜电位的绝对值变低。
  荧光强度降低，表示细胞超极化，探针流入细胞。显示细胞跨膜电位较原来的参照状态或参照细胞更负，膜电位的绝对值变高。